Zamonaviy molekulyar biologiya laboratoriyalarida spektrofotometrlar odatiy asbobga aylandi. Ko'pincha nuklein kislotasi, oqsil miqdorini aniqlash va bakterial o'sish kontsentratsiyasining miqdorini aniqlash uchun ishlatiladi.
Spektrofotometrning oddiy printsipi
Spektrofotometr bir nechta to'lqin uzunliklarini yaratadigan yorug'lik manbasini ishlatadi va ma'lum bir to'lqin uzunligining yorug'lik manbaini yaratish uchun bir qator spektroskopik asboblardan o'tadi. Yorug'lik manbai sinov uchun namunadan o'tgandan so'ng, yorug'lik manbasining bir qismi so'riladi va namunaning yutilishi hisoblab chiqiladi va shu bilan namuna kontsentratsiyasiga aylanadi. . Namunaning yutilishi namuna konsentratsiyasiga mutanosibdir.
Nuklein kislotalarning miqdorini aniqlash
Nuklein kislotalarning miqdorini aniqlash spektrofotometrning eng ko'p ishlatiladigan vazifasidir. Bir torli, ikki qatorli DNK va RNKni tamponda miqdorlash mumkin. Nuklein kislotaning eng yuqori yutilish cho'qqisi 260 nm ni tashkil qiladi. Har bir nuklein kislotaning molekulyar tarkibi har xil, shuning uchun konversiya omillari har xil. Turli xil nuklein kislotalarni miqdorini aniqlash uchun tegishli koeffitsientlarni oldindan tanlang. Masalan, 1 OD ning yutilishi 50 mkg / ml dsDNK, 37 mkg / ml ssDNK, 40 mkg / ml RNK va 30 mkg / ml Oligga to'g'ri keladi. Sinovdan keyin assimilyatsiya mos namuna konsentratsiyasini olish uchun yuqoridagi koeffitsientlarga o'zgartiriladi. Sinashdan oldin to'g'ri protsedurani tanlang, stok eritmasi va suyultiriladigan suyuqlik hajmini kiriting, so'ngra bo'sh va namunali eritmani sinab ko'ring. Biroq, tajriba har doim ham yumshoq bo'lmadi. Noturg'un o'qishlar eksperimentator uchun eng katta bosh og'rig'i bo'lishi mumkin. Yuqori sezgirlik bilan ishlaydigan asboblar assimilyatsiya qilishda katta siljishni ko'rsatadi.
Aslida, spektrofotometrning dizayn printsipi va ishlash printsipi assimilyatsiya ma'lum bir oraliqda o'zgarishiga imkon beradi, ya'ni asbob aniq aniqlik va aniqlikka ega. Masalan, Eppendorf biofotometrining aniqligi ≤1.0% (1A). Bunday bir nechta testlarning natijalari o'rtacha ko'rsatkichdan 1,0% gacha o'zgarib turadi va normaldir. Bundan tashqari, nuklein kislotaning o'zi va buferning nuklein kislotasi erigan tamponning fizik-kimyoviy xususiyatlarini, shuningdek ion kontsentratsiyasini va hokazolarni ham hisobga olish kerak: sinov davomida ion kontsentratsiyasi juda yuqori bo'lsa, o'qish siljishlari, shuning uchun ma'lum bir pH qiymati va past ion konsentratsiyasidan foydalanish tavsiya etiladi. TE kabi tamponlar o'qishni sezilarli darajada barqarorlashtiradi. Namunaning suyultirish kontsentratsiyasini ham e'tibordan chetda qoldirmaslik kerak: ba'zi bir mayda zarralar, ayniqsa nuklein kislota namunalari muqarrar ravishda mavjudligi sababli. Ushbu kichik zarralarning mavjudligi sinov natijalariga xalaqit beradi. Sinov natijalariga zarrachalarning ta'sirini minimallashtirish uchun nuklein kislotasining yutilishi kamida 0,1 A dan yuqori bo'lishi talab etiladi, assimilyatsiya esa 0,1 va 1,5 A oralig'ida bo'lishi kerak. zarralar nisbatan kichik va natijasi barqaror.
Bu shuni anglatadiki, namunaning konsentratsiyasi juda past yoki juda yuqori bo'lmasligi kerak (fotometrning sinov doirasidan tashqarida). Va nihoyat, aralashtirish kabi ishlaydigan omillar etarli bo'lishi kerak, aks holda assimilyatsiya qiymati juda past, hatto salbiy qiymatlar ham mavjud; aralashmaning pufakchalari mavjud bo'lishi mumkin emas, bo'sh suyuqlikda to'xtatilgan modda yo'q, aks holda o'qish keskin o'zgaradi; Bo'shliqni va namunani sinash uchun bir xil kvette ishlatilishi kerak, aks holda kontsentratsiyadagi farq juda katta; konversiya koeffitsienti va namuna kontsentratsiyasi birligi izchil tanlanadi; oyna kiygan kveteni ishlatib bo'lmaydi; namuna hajmi kuvvetka talab qiladigan minimal hajmga yetishi kerak.
Nuklein kislotasi kontsentratsiyasidan tashqari, spektrofotometr namunaning tozaligini ko'rsatadigan bir qator juda muhim nisbatlarni ko'rsatadi, masalan, namunaning tozaligini baholash uchun ishlatiladigan A 260 / A 280 nisbati, chunki oqsilning yutilish cho'qqisi. 280 nm. 1,8 (DNK) yoki 2,0 (RNK) dan katta nisbati bilan toza namunadir. Agar nisbat 1,8 yoki 2,0 dan past bo'lsa, bu protein yoki fenolik moddalarning mavjudligini ko'rsatadi. A 230, namunada uglevodlar, peptidlar, fenollar va boshqalar kabi ba'zi ifloslantiruvchi moddalar mavjudligini va A 260 / A 230 nuklein kislotasining nisbati 2,0 dan katta ekanligini ko'rsatadi. A 320 eritmaning xiralashganligini va boshqa shovqin omillarini aniqlaydi. Sof namunalar uchun A 320 odatda 0 ga teng.
Hangzhou Sumer Instrument Co., Ltd
Qo'shish: 310023, Xanchjou tumani, Yuxang tumani, Vuchang shoh ko'chasi, 168
TEL: + 86-571-88739859
Telefon: +8618658504900
Elektron pochta manzili: info@sumerlab.com
Veb: sumerinstrument.com