Spektrofotometrik kolorimetrik oqim miqdori
Proteinlar odatda oqsillar aralashmasi. Kolorimetrik tajribalar oqsil tarkibiga asoslangan: Aminokislotalar (masalan, tirozin, serin) rangli material ishlab chiqarish uchun qo'shimcha xromogen guruh yoki bo'yoq bilan reaksiyaga kirishadi. Rangli materialning kontsentratsiyasi bevosita protein reaksiyaga kiradigan aminokislotalar soniga bog'liq bo'lib, oqsil kontsentratsiyasini aks ettiradi.
Rangimetrik usul
BCA, Bredford va Lowry kabi bir qancha usullar mavjud.
Lowry usuli: Erta Biuret reaktsiyasiga asoslangan va yaxshilandi. Protein Cu2 bilan reaksiyaga kirib, ko'k reaksiya hosil qiladi. Shu bilan birga, Lowry usuli Biuretdan ko'ra sezgir. Ahvolga tushgan narsa - bir-biridan farqli reaktivlarni ketma-ket qo'shib qo'yish kerakligi; reaktsiya uzoq vaqt talab qiladi; oqsil bo'lmagan moddalarga sezgir; EDTA, Triton x-100 va ammiak sulfat o'z ichiga olgan proteinlar ushbu usul uchun mos emas.
Bicinchoniinine acid assay: Bu yangi, ko'proq sezgir protein tekshiruvidir. Tahlil qilinadigan protein Cu2 ni ishlab chiqarish uchun gidroksidli eritmada Cu2 bilan reaksiyaga kirib, 562 nmda assimilyatsiya zichligi bilan binafsha rangli birikma hosil qilish uchun BCA bilan xelat hosil qiladi. Ushbu birikma va protein konsentratsiyasi o'rtasidagi chiziqli munosabat kuchli va reaktsiyadan so'ng hosil bo'lgan birikma juda barqaror. Lowry uslubiga nisbatan operatsiya oddiy va sezuvchanlik yuqori. Shu bilan birga, Lowry uslubiga o'xshash oqsillar va yuvish vositalariga aralashishga moyil bo'ladi.
Bredford usuli: Bu usulning prinsipi shundaki, proteom 595 nm ga teng rangli birikma hosil qilish uchun Coomassie Brilliant Blue bilan reaksiyaga kiradi. Uning eng katta xususiyati - bu Lowry va BCA ning 2 barobaridan iborat bo'lgan sezgirligi. Bu oddiy va tezroq. Bu faqat reaktsiya reagentining bir turini talab qiladi. Murakkab natijani engillashtirish uchun 1 soat davomida stabil bo'lishi mumkin; Lowry bilan aralashuvlar BCA reducing agentlari (masalan, DTT, merkaptoetanol) bilan mos keladi. Biroq, deterjanlara hali sezgir. Asosiy kamchilikka ko'ra, turli xil standartlar bir xil misol natijalarida katta farqlarga olib kelishi va o'xshash natijalarga olib kelishi mumkin emas.
Kolorimetrik o'lchovlarga uchragan ayrim tadqiqotchilar turli rang o'lchovlari natijalari bo'yicha birinchi marta chalkashishi mumkin. Qanday usullarni aralashtirishga ishonasiz? Guruhlar turli usullar bilan reaksiyaga kirishganligi va xromogen guruhlar bir xil bo'lmasligi sababli, bir xil misol namunaviy kontsentratsiyasini barqaror qilish uchun bir vaqtning o'zida bir nechta usul ishlatiladi. Misol uchun, Keller va boshq. proteinni inson sutida sinab ko'rgan va Lowry va BCA bilan o'lchanadigan kontsentratsiyalar Bradforddan sezilarli darajada yuqori ekanligini aniqlagan. Farqi muhim edi. Xuddi shu namuna aniqlansa ham, xuddi shu kolorimetrik usuli bilan tanlangan standart namunadir qarama-qarshidir va testdan keyin kontsentratsiya ham barqaror emas. Masalan, 1.11 mg / ml konsentratsiyasi va 2.64 mg / ml konsentratsiyali standart sifatida globulin bilan standart sifatida BSA yordamida hujayra homogenatasidagi proteinni tekshirish uchun Lowry foydalaning. Shu sababli, kolorimetrik usuli tanlanmasidan oldin sinovdan o'tkaziladigan namunaning kimyoviy tarkibiga murojaat qilish va standart sifatida kimyoviy jihatdan o'xshash standart oqsilni topish afzalroqdir. Bundan tashqari, oqsillarni miqdoriy baholash uchun kolorimetrik usul ko'pincha namunaning absorbans qiymatining juda past bo'lishiga olib keladi, natijada o'lchangan namuna konsentratsiyasi va haqiqiy kontsentratsiya o'rtasidagi katta farq bo'ladi. Asosiy masala shundaki, 1011 spektrofotometrining muhim qismining rangi kubikning ma'lum bir yarim umrga ega ekanligi, shuning uchun har bir kolorimetrik usulda reaksiya sinov vaqtlari sanab o'tilgan. Barcha namunalar (standart namunalarni o'z ichiga olgan holda) ushbu vaqt ichida sinovdan o'tkazilishi kerak. Vaqt juda uzun bo'lsa, olingan absorbans qiymati kichikroq bo'ladi va kontsentrlangan kontsentratsiya qiymati kamayadi. Bunga qo'shimcha ravishda, reaksiya harorati, eritmaning pH qiymati va boshqalar eksperimentga ta'sir etadigan muhim omillar. Bundan tashqari, plastmassa rang o'lchagichni qo'llash juda muhimdir. Kuvars yoki shisha idishni ishlatishdan saqlaning, chunki reaksiya so'ng rangi kvars yoki shisha rangga olib kelishi va namunaning noaniq absorbansiga olib keladi.
Kompaniya spektrofotometrlarni sotishda ixtisoslashgan, maslahat va sotib olish kerak bo'lgan iste'molchilarga xush kelibsiz, biz sizga samimiy xizmat va sifatli mahsulotlarni taqdim etamiz, shuningdek, arzon narxlarni taklif qilamiz.
E-mail: info@sumerlab.com
Veb: sumerinstrument.com